LncRNA

樣本類型

樣本要求

保存及運(yùn)輸條件

說(shuō)明內(nèi)容

新鮮組織

新鮮組織標(biāo)本（腫瘤樣本在術(shù)后30分鐘內(nèi)取得）≥50 mg（黃豆粒大小）可采用以下方法：

1.RNAlater：尤其適用于腫瘤組織，離體后于冰上快速切成小塊，組織塊直徑最好介于1-5 mm（小米至綠豆大小），浸泡在5倍體積的RNAlater中，充分浸潤(rùn)（最好4℃過(guò)夜，以保證浸潤(rùn)效果），-80℃保存；如果是腫瘤樣本，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤組織和正常組織。

2.TRIzol：在冰上快速分成小塊，組織塊直徑最好不大于5 mm（綠豆大小）浸泡于TRIzol中，凍存管或者離心管封口膜封好后送樣。

3.液氮：離體后液氮速凍充分，預(yù)冷凍存管，將組織轉(zhuǎn)移至凍存管中，液氮可長(zhǎng)期保存。

干冰運(yùn)輸

建議樣本備份1-2份，收樣后立即提取。

細(xì)胞

提取mRNA需細(xì)胞數(shù)量＞5×10⁶個(gè)，lncRNA需＞1×10⁷個(gè)。

1.懸浮細(xì)胞收集用PBS緩沖液快速洗一次，每5×10⁶個(gè)細(xì)胞加入1 mL TRIzol，用移液器吹散，溶液呈清亮不粘稠狀；-80℃保存不超過(guò)1個(gè)月；

2.貼壁細(xì)胞需將培養(yǎng)基盡量吸棄；按每10 cm²培養(yǎng)面積（相當(dāng)于六孔板一個(gè)孔或35 mm直徑培養(yǎng)皿）加1 mL TRIzol；移液器反復(fù)吹打，使TRIzol完全接觸長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶表面，充分消化；轉(zhuǎn)移到RNase-free的離心管中，用一次性注射器反復(fù)吹打細(xì)胞直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊，整個(gè)溶液呈清亮不粘稠狀，-80℃保存。

干冰運(yùn)輸

建議樣本備份1-2份，收樣后立即提取。

外周血（RNA）

1.TRIzol：15 mL管中加入6 mL TRIzol和2 mL新鮮血液（TRIzol：血液=3：1），移液器吹打以幫助裂解樣品中的細(xì)胞；樣品劇烈震蕩混勻1-2 min，直到絮狀物全部溶解；室溫孵育5 min使核蛋白體完全分解；封口膜封存，-80℃凍存。

注意：冰凍血液溶解過(guò)程中會(huì)有破碎的細(xì)胞釋放RNA酶，因此建議在冰凍前加入TRIzol，切勿直接凍存新鮮血液，保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融。離心得到白細(xì)胞或有核細(xì)胞，可加TRIzol，-80℃保存，干冰運(yùn)輸。

2.BD PAXgene Blood RNA Tube：人類血液樣本推薦使用，采集量為2mL左右，18-25℃可保存3天，2-8℃可保存5天，-20℃或-70℃至少可穩(wěn)定50個(gè)月。

3.使用RNAlock血液RNA穩(wěn)定劑保存，新鮮抗凝血液：血液RNA穩(wěn)定劑=1：3，蓋上管蓋，上下顛倒混勻8-10次。室溫放置2h以上后低溫保存；含有血液RNA穩(wěn)定劑的人血液樣品可在2-8℃保存5天，或在-20℃條件下至少保存三個(gè)月；含有血液RNA穩(wěn)定劑的哺乳動(dòng)物血液樣品可在15-25℃保存2天，2-8℃保存7天，或在-20℃條件下至少保存六個(gè)月。

TRIzol保存法需干冰運(yùn)輸；BD PAXgene Blood RNA Tube保存法可使用足量冰袋，用泡沫箱運(yùn)輸

TotalRNA

總RNA溶解于DEPC水或者RNase-free的緩沖液中。純度OD_260/280≥2.0；濃度≥100 ng/μL。

所需樣本量與樣本降解程度，即RIN值的大小有關(guān)：RIN≥8.0，總量≥3 μg；RIN在6.0-8.0之間，總量≥4 μg；RIN<6.0，總量≥6 μg。lncRNA測(cè)序采用ribo-zero方法去除rRNA。RIN<6.0的降解比較嚴(yán)重的RNA樣本建議采用Ribo-Zero方法建庫(kù)，不建議用TruSeq方法。

使用1.5 mL或2 mL離心管盛放，用parafilm封口膜密封，然后將樣本管置于保護(hù)用的50 mL離心管或其他類似容器里，并旋緊蓋子。使用足量冰袋，用泡沫箱運(yùn)輸。

Ribo-Zero法適用于降解樣本（低RIN值）RNA測(cè)序、lncRNA測(cè)序等。